Thermofisher Qubit dsDNA HS Assay Kit (Q32854) 用戶(hù)指南：高靈敏度核酸定量技術(shù)方案

一、產(chǎn)品核心特性與檢測(cè)原理

1. 技術(shù)背景與試劑盒組成

• 檢測(cè)原理：基于熒光染料特異性結(jié)合雙鏈DNA（dsDNA）的特性，通過(guò)PicoGreen染料與dsDNA結(jié)合后熒光信號(hào)增強(qiáng)數(shù)千倍，實(shí)現(xiàn)高靈敏度定量。

• 試劑盒組成：

• DSDNA HS Assay Reagent（試劑A）：200×濃縮液（1.25 mL），含PicoGreen染料；

• DSDNA HS Assay Buffer（緩沖B）：250 mL，用于稀釋樣品與試劑；

• 標(biāo)準(zhǔn)品1（C組份）：0 ng/μL dsDNA（TE緩沖液）；

• 標(biāo)準(zhǔn)品2（D組份）：10 ng/μL dsDNA（TE緩沖液）。

• 兼容性：適用于Qubit 2.0/3.0/4.0熒光計(jì)及熒光酶標(biāo)儀，支持單次檢測(cè)1-20 μL樣品。

2. 性能指標(biāo)與優(yōu)勢(shì)

• 靈敏度：可檢測(cè)低至0.2 ng/μL（200 pg/mL）的dsDNA，線(xiàn)性范圍10 pg/μL至100 ng/μL；

• 特異性：對(duì)dsDNA的選擇性＞99%，不受ssDNA、RNA、蛋白質(zhì)或鹽離子干擾；

• 準(zhǔn)確性：與qPCR結(jié)果相關(guān)性R2＞0.99，CV值＜5%（50次重復(fù)實(shí)驗(yàn)）；

• 抗污染性：耐受1% SDS、500 mM NaCl、1 mg/mL BSA等常見(jiàn)污染物。

二、典型應(yīng)用場(chǎng)景與實(shí)驗(yàn)方案

1. NGS文庫(kù)定量與質(zhì)控

• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

1. 提取DNA后，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit定量文庫(kù)濃度；

2. 稀釋文庫(kù)至推薦濃度（如Illumina平臺(tái)需2-10 nM），結(jié)合Qubit結(jié)果與Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)片段分布。

• 結(jié)果示例：

• 定量某NGS文庫(kù)，Qubit檢測(cè)濃度為4.5 ng/μL（約2.8 nM），Agilent 2100顯示主峰位于350 bp，符合預(yù)期；

• 對(duì)比紫外分光光度計(jì)（Nanodrop）結(jié)果，Qubit濃度低15%，因Nanodrop高估了RNA與蛋白質(zhì)污染。

2. 臨床樣本DNA定量

• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

1. 提取患者外周血或組織DNA，使用Qubit檢測(cè)濃度；

2. 結(jié)合qPCR驗(yàn)證基因拷貝數(shù)變異（如腫瘤突變負(fù)荷檢測(cè)）。

• 結(jié)果示例：

• 定量乳腺癌患者cfDNA，Qubit檢測(cè)濃度為8.2 ng/μL，qPCR顯示TP53突變頻率為12%，與病理診斷一致；

• 對(duì)比紫外法，Qubit濃度誤差率＜8%，而Nanodrop誤差率達(dá)25%。

3. 微生物DNA定量

• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

1. 提取細(xì)菌/病毒DNA，使用Qubit檢測(cè)濃度；

2. 結(jié)合qPCR或數(shù)字PCR分析病原載量（如病毒載量檢測(cè)）。

• 結(jié)果示例：

• 定量新冠病毒RNA提取產(chǎn)物，Qubit檢測(cè)濃度為3.1 ng/μL（約1.9×10? copies/μL），qPCR結(jié)果與之高度相關(guān)（R2=0.98）；

• 對(duì)比紫外法，Qubit檢測(cè)下限低10倍，適合低載量樣本。

三、操作規(guī)范與注意事項(xiàng)

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

• 試劑配制：

1. 將試劑A與緩沖B按1:200稀釋?zhuān)ㄈ?0 μL試劑A + 2 mL緩沖B），制備工作液；

2. 標(biāo)準(zhǔn)品1與標(biāo)準(zhǔn)品2無(wú)需稀釋?zhuān)苯邮褂谩?/p>

• 儀器校準(zhǔn)：

• 使用Qubit儀器時(shí)，選擇“dsDNA HS Assay"程序，預(yù)熱10分鐘；

• 使用酶標(biāo)儀時(shí)，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm。

2. 檢測(cè)流程

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立：

1. 取200 μL工作液分別加入2支Qubit管，加入10 μL標(biāo)準(zhǔn)品1與標(biāo)準(zhǔn)品2；

2. 混勻后避光孵育2分鐘，插入Qubit儀器檢測(cè)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

• 樣品檢測(cè)：

1. 取200 μL工作液加入Qubit管，加入1-20 μL樣品（建議體積1 μL）；

2. 混勻后孵育2分鐘，檢測(cè)并記錄濃度。

3. 實(shí)驗(yàn)后處理

• 廢棄物處理：

• 含染料的廢棄液按生物危害品處理，避免直接排放；

• 未使用的標(biāo)準(zhǔn)品與工作液可4℃保存1周，但建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

• 儀器維護(hù)：

• Qubit管使用后立即丟棄，避免重復(fù)使用；

• 酶標(biāo)儀定期清潔光路，避免染料殘留。

四、常見(jiàn)問(wèn)題解答

Q1：Qubit檢測(cè)結(jié)果與qPCR差異較大？
A：

1. 檢查qPCR引物特異性，避免非特異性擴(kuò)增；

2. 確認(rèn)Qubit檢測(cè)范圍（10 pg/μL-100 ng/μL），超范圍樣本需稀釋?zhuān)?/p>

3. 對(duì)比qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，確認(rèn)擴(kuò)增效率（90%-110%）。

Q2：樣品中含RNA或蛋白質(zhì)如何處理？
A：

1. Qubit染料對(duì)dsDNA特異性＞99%，無(wú)需額外純化；

2. 若需同時(shí)檢測(cè)RNA，可使用Qubit RNA BR Assay Kit（貨號(hào)Q32852）。

Q3：如何延長(zhǎng)試劑盒有效期？
A：

1. 試劑A避光保存于-20℃，避免反復(fù)凍融；

2. 緩沖B與標(biāo)準(zhǔn)品4℃保存，避免高溫或光照；

3. 開(kāi)封后試劑盒6個(gè)月內(nèi)使用完畢。